北京最好手足癣医院 https://m-mip.39.net/czk/mipso_8833740.html摘要：目的探究槐定碱对永久性大脑中动脉栓塞（permanentmiddlecerebralarteryocclusion，pMCAO）大鼠脑细胞的作用及机制。方法SD大鼠随机分为对照组、模型组和槐定碱低、中、高剂量（2.5、5.0、10.0mg/kg）组，给予槐定碱5d后，建立pMCAO大鼠模型。考察槐定碱对pMCAO大鼠神经功能评分的影响；考察槐定碱对pMCAO大鼠脑梗死率的影响；采用流式细胞术检测各组大鼠缺血半暗带区细胞凋亡率；采用苏木素-伊红（HE）染色法观察各组大鼠脑组织病理变化；采用Westernblotting法考察各组大鼠脑组织B细胞淋巴瘤-2（B-celllymphoma2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表达情况。结果与模型组比较，槐定碱组大鼠神经缺陷症状改善，脑梗死率显著降低（P＜0.05、0.01），缺血半暗带细胞凋亡率明显降低（P＜0.05、0.01），脑组织损伤有所改善，脑组织Caspase-3和Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01）。结论槐定碱对pMCAO大鼠脑细胞具有保护作用，其机制可能与上调Bcl-2及下调Bax、Caspase-3蛋白表达水平，进而抑制细胞凋亡有关。
脑梗死是临床中常见的脑血管疾病，组织缺血缺氧导致坏死或软化，严重危害人类的生命。细胞凋亡是脑梗死引起神经损伤的重要机制之一，缺血缺氧下凋亡相关信号通路激活，引起神经细胞凋亡，脑梗死灶体积和神经功能缺损严重程度与细胞凋亡程度呈正相关[1]。槐定碱是从豆科槐属植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.中提取分离的单体生物碱，具有抑制炎性因子分泌、抗氧化、抗癌、保护心脑血管等作用[2-3]。槐定碱能够通过下调肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumornecrosisfactorreceptorassociatedfactor6，TRAF6）、上调磷酸化细胞外信号调节激酶1/2（extracellularregulatedkinase1/2，p-ERK1/2）表达，从而减轻大鼠脑损伤和脑水肿程度[4]。本课题组前期研究表明，槐定碱能够抑制氧化应激和炎性反应，对局灶性脑缺血大鼠具有神经保护作用[5]。本研究探究槐定碱对永久性大脑中动脉栓塞（permanentmiddlecerebralarteryocclusion，pMCAO）大鼠脑细胞凋亡的影响，为槐定碱的临床应用提供依据。
1材料
1.1动物
清洁级SD大鼠70只，雌雄各半，8周龄，体质量～g，购自宁夏医科大学实验动物中心，动物许可证号SYXK（宁）。动物于温度（24±1）℃、湿度50%～70%的环境中适应性饲养1周，自由进食饮水。动物实医院伦理委员会批准（批准号）。
1.2药品与试剂
槐定碱（质量分数＞98%，批号）购自宁夏药物研究所；BCA蛋白定量试剂盒、AnnexinV-FITC/碘化丙啶（PI）细胞凋亡检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（批号T）购自北京索莱宝科技有限公司；兔源B淋巴细胞瘤2（B-celllymphoma2，Bcl-2）抗体（批号sc-）购自美国SantaCruz公司；兔源Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associatedXprotein，Bax）抗体（批号s）、兔源半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体（批号s）、β-actin抗体（批号s）、HRP标记的山羊抗兔抗体购自美国CST公司。
1.3仪器
PAC电泳仪、FACSCanto流式细胞仪、GelDocXR＋凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司）；TS-8S型双层脱色摇床（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；JY92-ⅡD型超声波细胞破碎机（南京贝帝实验仪器有限公司）。
2方法
2.1分组与给药
SD大鼠随机分为对照组、模型组及槐定碱低、中、高剂量（2.5、5.0、10.0mg/kg）组[4]，每组14只。槐定碱溶于0.9%氯化钠溶液，分别配制成质量浓度为2.5、5.0、10.0mg/mL的溶液。各给药组ip相应溶液（1mL/kg），对照组和模型组ip等体积0.9%氯化钠溶液，1次/d，连续5d。末次给药后，模型组和各给药组立即制备pMCAO模型。
2.2pMCAO模型的制备
采用Longa改良线栓法[6]建立大鼠pMCAO模型，大鼠ip20%乌拉坦（6mL/kg）麻醉后，于颈部正中切口并进行动脉分离，结扎右侧颈总动脉近心端，在颈内动脉下方穿线备用；在右侧颈总动脉距离分叉约4mm处剪口，将栓线经过颈内动脉插入大脑中动脉起始端（栓线最远端距分叉处18～20mm），阻断大脑中动脉供血；结扎颈内动脉固定拴线，记录时间作为大脑局灶性缺血开始的时间，线栓阻断血流24h。对照组仅进行动脉分离，不插线。
2.3槐定碱对pMCAO大鼠神经功能评分的影响
术后大鼠进行神经行为症状评分，判定神经功能损伤程度[6]。评分标准：0分为大鼠无神经功能缺失症状；1分为大鼠梗死对侧前爪内收、不能伸展对侧前肢；2分为大鼠前肢屈曲对侧抵抗推力下降，行走时向偏瘫侧旋转；3分为大鼠行走时向偏瘫侧倾倒；4分为大鼠不能自发行走，意识丧失。
2.4槐定碱对pMCAO大鼠脑梗死率的影响
术后各组随机选取5只大鼠，断头处死，取脑，去掉嗅球、小脑和低位脑干，以2mm为间隔行脑组织冠状切片，于2%TTC染液中避光孵育30min，于4%多聚甲醛溶液中固定1h，拍照并观察梗死情况，红色区域为正常脑组织，白色区域为梗死病变的脑组织，采用ImageJ软件计算脑梗死率[7]。
脑梗死率＝脑梗死体积/全脑体积
2.5槐定碱对pMCAO大鼠缺血半暗带区细胞凋亡的影响
大鼠ip20%乌拉坦麻醉，打开胸腔，用mL4%多聚甲醛进行心脏灌注。大鼠断头处死，取60mg大脑缺血半暗带区组织，即右侧大脑半球距离嗅球尖端7～11mm额顶皮质上部，制成单细胞悬液，调整细胞密度至1×/L，0r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀加入5μLAnnexinV-FITC和PI，避光孵育，再加入μL1×BindingBuffer，采用流式细胞仪于1h内检测细胞凋亡情况[8]。
2.6槐定碱对pMCAO大鼠脑组织病理变化的影响
大鼠断头取脑，取缺血部位脑组织，于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脱水、无水乙醇及二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋后切片（厚5μm），冠状切片贴于载玻片上，于4℃保存；石蜡切片经脱蜡、染色、脱水、透明后，中性树脂封片，于显微镜下观察脑组织病理变化。
2.7槐定碱对pMCAO大鼠脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响
取大鼠缺血部位脑组织，于液氮中研碎，加入裂解液提取总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，于5%脱脂牛奶室温封闭2h，分别加入Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin抗体（1∶），4℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔抗体室温孵育2h，加入ECL试剂显影，采用QuantityOne软件分析。
2.8统计学处理
数据以表示，采用SPSS22.0软件进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），两两之间比较采用最小显著差数法。
3结果
3.1槐定碱对pMCAO大鼠神经功能评分的影响
如表1所示，对照组大鼠神经功能正常，模型组大鼠出现缺血对侧前肢不能伸直、转圈等不同程度的神经缺陷症状。与模型组相比，各给药组大鼠神经缺陷症状得到改善。
3.2槐定碱对pMCAO大鼠脑梗死率的影响
如图1所示，与对照组比较，模型组大鼠脑梗死率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，槐定碱中、高剂量组大鼠脑梗死率显著降低（P＜0.05、0.01）。
3.3槐定碱对pMCAO大鼠缺血半暗带区细胞凋亡的影响
如图2所示，与对照组比较，模型组大鼠缺血半暗带细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠缺血半暗带细胞凋亡率明显降低（P＜0.05、0.01）。
3.4槐定碱对pMCAO大鼠脑组织病理变化的影响
如图3所示，对照组大鼠大脑皮质结构完整，神经细胞排列及形态正常，胞膜完整，胞质丰富，核仁清楚；模型组大鼠大脑皮质广泛水肿，细胞排列紊乱，胞质空泡样变，部分核固缩，核仁消失，神经元数目明显减少，间质血管扩张充血，炎性细胞浸润；与模型组相比，各给药组大鼠脑组织水肿减轻，神经细胞形态有所改善，核固缩和核溶解程度减轻，细胞凋亡与坏死减少，神经元数目增加。
3.5槐定碱对大鼠pMCAO脑组织Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表达的影响
如图4所示，与对照组比较，模型组大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），Bax和Caspase-3蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠脑组织Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01），Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01），槐定碱中、高剂量组Caspase-3蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。
4讨论
缺血性脑卒中是临床上常见且多发的疾病，其病理过程涉及脑组织能量代谢障碍、神经细胞内钙超载、氧化应激损伤、炎性反应、细胞凋亡等多个环节，其中神经细胞凋亡是脑缺血损伤的重要环节[9]。脑细胞缺血缺氧后，脑梗死区域与正常脑组织间存在以细胞凋亡为主的缺血半暗带区，通过调节该区域神经细胞的凋亡，能够有效减少神经细胞坏死数量和梗死区域面积，减轻神经功能损伤[10]。因此，及时、有效地阻止脑缺血后神经细胞凋亡，对减轻脑缺血损伤尤为重要。研究发现，中药能够通过调节线粒体凋亡途径抑制细胞凋亡，从而发挥脑神经保护作用[11]。课题组前期研究发现，槐定碱对局灶性脑缺血大鼠模型具有神经保护作用。Bcl-2家族蛋白在线粒体介导的细胞凋亡中发挥着关键性作用，能够通过控制线粒体膜的通透性，影响凋亡相关因子的释放，进而调控细胞凋亡[12]。由线粒体释放的细胞色素C（cytochromeC，CytC）与凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor1，Apaf-1）结合形成凋亡小体，进而促进Caspase前体活化，启动Caspase级联反应[13]。Caspase家族是细胞凋亡的效应器，能够引发细胞骨架重排、DNA断裂等细胞生化和形态学的改变，Caspase-3是Caspase级联反应下游最关键的凋亡执行蛋白酶，Caspase-3的活化可引起细胞凋亡[14]。Bax为促凋亡蛋白，能够增加线粒体外膜通透性，促进凋亡相关因子的释放；Bcl-2为抗凋亡蛋白，通过与Bax形成异源二聚体，抑制Bax的促凋亡作用[15]。研究发现，急性脑梗死患者血清中Bcl-2表达明显下降[12]。Bcl-2与Bax之间的平衡维持着细胞凋亡的稳态，脑缺血后Bcl-2/Bax下降，Caspase-3被激活，进而导致凋亡的发生[16]。本研究结果显示，脑缺血24h后大鼠神经功能缺陷症状明显且细胞凋亡率显著增加，槐定碱能够明显改善pMCAO大鼠的神经功能症状，减小脑梗死率，降低缺血半暗带处细胞的凋亡率，减轻pMCAO大鼠病理性损伤，维持细胞的正常形态，抑制神经细胞凋亡和坏死。大鼠局灶性脑缺血后神经细胞的死亡可能与Bcl-2、Bax和Caspase-3凋亡途径的激活有关，本研究发现，槐定碱能够抑制pMCAO大鼠脑组织Bax的上调和Bcl-2的下调，维持Bcl-2与Bax之间的平衡，从而抑制Caspase-3的上调，从而抑制脑缺血后神经细胞凋亡。
综上，槐定碱能够通过改善脑细胞凋亡情况、减轻pMCAO大鼠神经损伤程度，从而发挥神经保护作用。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：薛玉梅，李献军，孟岩，宋哲，刘惠钦，李晓兵．槐定碱对永久性大脑中动脉栓塞大鼠脑细胞的作用及机制研究[J].中草药,,52(11):-.
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